De Tanenbaum groep gebruikt innovatieve ‘single-molecule’ microscopie methodes en nieuwe methodes van genetische modificaties om met zeer hoge resolutie regulatie van gen expressie te bestuderen in levende cellen. Met ons onderzoek willen we begrijpen hoe de regulatie van genexpressie belangrijke intracellulaire beslissingen beïnvloedt in gezonde en zieke cellen. Wij focussen ons zowel op regulatie van menselijke genen, als ook op regulatie van gen expressie van verschillende RNA virussen. Daarnaast ontwikkelen we nieuwe imagingtechnieken om continu de grens te verleggen van in vivo moleculaire analyses. We zoeken mensen voor verschillende functies!!! –> Meer informatie te vinden onderaan deze pagina Figuur 1. Single-molecule imaging van mRNA-translatie met behulp van het SunTag-systeem. (A) Schema van de SunTag-fluorescentielabelstrategie. (B) Imaging van individuele mRNA-moleculen in levende cellen. Moleculaire analyse van genexpressie in levende cellen Een aantal jaar geleden hebben wij een nieuwe imagingtechniek ontwikkeld: “SunTag” (Tanenbaum et al., 2014, Cell). Hiermee kunnen we een groot aantal GFP’s koppelen aan een eiwitmolecuul dat we willen onderzoeken (figuur 1A). Deze GFP-multimerisatie benadering maakt de fluorescentie labels veel helderder dan voorheen mogelijk was, en stelt ons in staat om complexe biologische processen met een gevoeligheid van individuele moleculen in real-time in levende cellen te visualiseren. Met behulp van de SunTag-technologie kunnen we de translatie van afzonderlijke mRNA moleculen in ruimte en tijd continu volgen (figuur 1B; Yan et al., 2016, Cell). We gebruiken de SunTag-technologie om genexpressiecontrole in levende cellen te visualiseren met ongelooflijke precisie, zodat we kunnen ontdekken hoe regulerende mechanismen op moleculair niveau werken en hoe de regulatie van eiwitexpressie het lot van de cel beïnvloedt (bv Boersma et al., 2019, Cell; Hoek et al., 2019, Mol Cell). We gebruiken een combinatie van kwantitatieve single-cell en single-molecule fluorescentiemicroscopie en computersimulaties om verder te kijken dan de gemiddelden van een celpopulatie, en bestuderen hoe afzonderlijke cellen over tijd hun genexpressie beïnvloeden (bv Ruijtenberg et al., 2020, Nat Struc Mol Biol). Visualisatie van individuele RNA virussen RNA-virussen behoren wereldwijd tot de meest voorkomende pathogenen en vormen een grote belasting voor de samenleving. RNA virussen worden al tientallen jaren bestudeerd, maar er is verrassend weinig bekend over de processen die plaatsvinden tijdens vroege virale infectie. De eerste uren van infectie zijn desondanks erg belangrijk, omdat de uitkomst van de infectie (bijv. kan het virus zich vermenigvuldigen in de gastheer cel? Kan de gastheer cel het virus detecteren en voorkomen dat het zich verspreidt?) in de vroege stadia van infectie vaak al wordt bepaald.. Gebrek aan begrip van vroege infectie is grotendeels te wijten aan een gebrek aan assays die gevoelig genoeg zijn om virale detectie te detecteren in vroege infectie, aangezien tijdens de vroege stadia slechts één of enkele virale RNA’s per gastheercel aanwezig zijn. Wij hebben recentelijk een single-molecule imaging assay ontwikkeld op basis van onze SunTag-technologie, VIRIM genaamd, die detectie van enkele virale RNA’s mogelijk maakt, en die daarom bij uitstek geschikt is om vroege virale infectie te bestuderen (Boersma et al, 2020, Cell). Met behulp van VIRIM kunnen we het moment van gastheer entry van individuele virussen detecteren en virale translatie en replicatie in afzonderlijke cellen volgen. Verrassend genoeg zien we een grote mate van heterogeniteit in de dynamiek van virale infectie in verschillende cellen, waarbij virussen zich snel repliceren tot hoge aantallen in sommige cellen, terwijl ze helemaal geen replicatie vertonen in andere cellen. Een vergelijkbare heterogeniteit wordt waargenomen in de reactie van de gastheer op de infectie, die van cruciaal belang is om het virus te bestrijden. We gebruiken VIRIM om de mechanismen bloot te leggen die ten grondslag liggen aan heterogeniteit bij infectie en proberen te begrijpen hoe gen expressie van virus en gastheer worden gecoördineerd om respectievelijk virale replicatie en antivirale signalering te optimaliseren. Dot onderzoek zal hopelijk leiden tot vernieuwde inzichten in gen expressie regulatie van gastheer en virus en op de lange termijn dienen voor de ontwikkeling van nieuwe gerichte therapieën tegen virusinfecties. Figuur 2. Genactivering met behulp van synthetische transcriptiefactoren. (A) Een nuclease-dood CRISPR/Cas9-eiwit wordt gefuseerd aan een array van transcriptieactiveringsdomeinen via SunTag en wordt gericht op een endogene genpromotor om de transcriptie aan te zetten. (B) K562-cellen waarin de membraanreceptor CXCR4 (rood) in de onderste twee cellen is aangezet met behulp van CRISPRa. (C) K562-cellen waarin de CXCR4-genactiviteit kunstmatig wordt gemoduleerd, vertonen een verhoogde celmigratie. Manipulatie van genexpressie met synthetische transcriptiefactoren De controle van genexpressie is van cruciaal belang voor het lot en de homeostase van de cel, en is vaak uit balans bij ziekten zoals kanker. Om de functie van genexpressie-regulatie te onderzoeken, is het cruciaal om dit proces te kunnen verstoren. Het moduleren van de expressie van endogene genen blijkt echter zeer uitdagend. Onlangs hebben we in samenwerking met het laboratorium van Jonathan Weissman (UCSF) een nieuw systeem ontwikkeld om transcriptiesnelheden van endogene genen te moduleren. In dit systeem wordt een nuclease-dood CRISPR/Cas9-eiwit met SunTag gefuseerd aan transcriptieactiveringsdomeinen en gericht op een endogene genpromotor, zodat de transcriptie kan worden gemoduleerd (figuur 2) (Tanenbaum et al., 2014, Cell). We gebruiken deze nieuwe technologie om te bestuderen hoe transcriptionele regulatie belangrijke celcyclusovergangen aanstuurt, en hoe het samenspel werkt tussen transcriptionele controle en andere regulerende mechanismen voor genexpressie, zoals mRNA-stabiliteit en -vertaling.
