Nieuwe assay werpt licht op histonen en hun chaperonnes

Histon-chaperonnes zijn verantwoordelijk voor het plaatsen van histonen op het DNA en spelen daarom een belangrijke rol bij het verpakken van het DNA in cellen en het reguleren van de toegankelijkheid ervan. Onderzoekers van de Mattiroli groep ontwikkelden een nieuwe fluorescentie-assay en gebruikten deze om ANP32B te identificeren als de histon-chaperonne die verantwoordelijk is voor het reguleren van een specifiek histon, macroH2A. De resultaten zijn op 18 oktober 2023 gepubliceerd in Cell Reports en vormen een basis voor toekomstig onderzoek naar de interactie tussen deze twee eiwitten en hun rol tijdens de ontwikkeling en bij kanker.

Elke cel van het menselijk lichaam bevat ongeveer twee meter DNA. Om dit in de celkern te passen, wordt het DNA stevig verpakt door het rond eiwitten te wikkelen die histonenEiwitten in de celkern waar het DNA omheen is gewonden. Op deze manier past al het DNA in de celkern. Door aanpassingen aan de histonen wordt het DNA strakker of losser gewonden, waardoor de genen op die plek wel of niet afgelezen kunnen worden. worden genoemd. Dit maakt niet alleen de opslag van het DNA compact, maar beschermt het DNA ook en regelt welke delen van het DNA toegankelijk zijn. De histonen worden door histon-chaperonnes op het DNA geplaatst. Deze ‘eiwithulpjes’ zorgen ervoor dat histonen op het juiste moment op de juiste plek worden gezet. In deze studie wilden onderzoekers van de Mattiroli groep het chaperonne-eiwit opsporen dat verantwoordelijk is voor het op het DNA plaatsen van een specifiek histoneiwit, macroH2A.

Tot zwijgen brengen van DNA-regio’s

Imke Mandemaker, eerste auteur van de studie, legt de functie van macroH2A uit: “MacroH2A is het grootste histon en het is vooral aanwezig in ontoegankelijke stukken DNA, waar het het DNA extra compact maakt. Hoe compacter een DNA-regio is verpakt, hoe minder toegankelijk deze is voor enzymenEiwitten die een specifieke chemische reactie versnellen, bijvoorbeeld de afbraak van een molecuul. Tijdens deze reactie wordt het enzym zelf niet verbruikt, waardoor het zijn functie keer op keer kan uitoefenen. Enzymen bevinden zich zowel binnen als buiten de cel. die de DNA-informatie gebruiken om het gedrag van de cel te bepalen. Daarom wordt macroH2A vooral geassocieerd met het ‘silencen’ van delen van het DNA, wat betekent dat de informatie niet wordt gebruikt. MacroH2A is bijvoorbeeld belangrijk bij het ‘silencen’ van de stamcel-achtige eigenschappen van cellen, waarmee het verhindert dat de gespecialiseerde cellen van het lichaam terug veranderen in stamcellenCellen die nog niet gespecialiseerd zijn, maar waaruit verschillende soorten gespecialiseerde cellen kunnen ontstaan.. Aangezien zo’n verandering naar een stamcelachtige toestand ook plaatsvindt tijdens de ontwikkeling van kanker, zou het kunnen dat macroH2A een belangrijke rol speelt bij het voorkomen van kanker. Daarom zijn zowel macroH2A zelf als zijn regulatoren interessante therapeutische targets die we willen begrijpen.”

Schematische weergave van de fluorescentie-assay die de onderzoekers gebruikten om de hoeveelheid macroH2A op het DNA te meten. De donkerblauwe lijn stelt het DNA voor, dat rond histonen (lichtblauw) is gewikkeld. Samen wordt dit het nucleosoom genoemd. Eén van de histonen is macroH2A (oranje). GFP is het fluorescerende eiwit, dat alleen groen licht uitzendt als de twee delen (N-GFP en C-GFP) samenkomen. Dit gebeurt als macroH2A zich op het DNA bevindt, dicht bij het andere histon (rechter afbeelding). Credit: Imke Mandemaker. Copyright: Hubrecht Institute.

Eén plus één is licht

De onderzoekers gingen daarom op zoek naar de histon-chaperonne die verantwoordelijk is voor macroH2A. Om dit mogelijk te maken, moesten ze eerst een nieuwe strategie ontwikkelen. Mandemaker deed dit tijdens haar verblijf in München, in het laboratorium van Andreas Ladurner. Mandemaker vertelt: “We hebben een nieuwe fluorescentie-assay ontwikkeld waarmee we de hoeveelheid macroH2A in levende menselijke cellen kunnen meten, door te kijken naar de hoeveelheid uitgezonden licht. Hiervoor hebben we gebruikgemaakt van een fluorescerend eiwit dat in twee delen kan worden gesplitst. Alleen als deze twee delen dicht genoeg bij elkaar komen, kunnen ze het volledige eiwit vormen dat licht uitzendt. De ene helft hebben we vastgemaakt aan macroH2A en de andere helft aan een histon dat altijd op het DNA aanwezig is. Als we licht meten, weten we daarom dat macroH2A zich op het DNA bevindt, dicht bij het andere histon. De hoeveelheid licht die we meten is evenredig aan de hoeveelheid macroH2A op het DNA.”

Microscopische foto van menselijke cellen gekleurd voor macroH2A en DNA — Microscopische foto van menselijke cellen waaraan de opgezuiverde histon-chaperonne ANP32B is toegevoegd. Te zien is de daaropvolgende afzetting van het histon macroH2A (groen) op het DNA (magenta). Credit: Imke Mandemaker. Foto gemaakt in het laboratorium van Andreas Ladurner in München.

Histon-chaperonne geïdentificeerd

Mandemaker en collega’s van het laboratorium van Lucas Jae gebruikten deze nieuwe assay vervolgens om een grote genetische screening uit te voeren, waarbij ze konden zien wat het effect was van het verstoren van genenKleine gebiedjes in het DNA met een specifieke functie. Genen bepalen onder andere welke oogkleur we hebben en of ons haar krult of juist steil is. Het DNA in een menselijke cel omvat ongeveer 30.000 genen, met elk een eigen functie. Genen zijn erfelijk en kunnen dus doorgegeven worden aan het nageslacht. op de hoeveelheid macroH2A op het DNA. “Als je een gen verstoort en de hoeveelheid licht wordt minder, betekent dit dat er minder macroH2A aanwezig is. Dat is dus een indicatie dat het verstoorde gen codeert voor een eiwit dat betrokken is bij het plaatsen van macroH2A op het DNA”, zegt Mandemaker. “Op deze manier konden we de histon-chaperonne ANP32B identificeren als potentiële kandidaat. Met behulp van verschillende andere technieken, waaronder een genoom-brede analyse van macroH2A-lokalisatie in samenwerking met het lab van Marcus Buschbeck, hebben we bevestigd dat dit inderdaad het eiwit is dat verantwoordelijk is voor het plaatsen van macroH2A op het DNA. Zowel macroH2A als ANP32B waren al lange tijd bekend, maar dankzij de fluorescentie-assay hebben we nu de link tussen deze eiwitten geïdentificeerd. Dit werk dient als basis voor toekomstig onderzoek gericht op begrijpen waarom ANP32B specifiek bindt aan macroH2A en wat de rol van deze eiwitten is bij kanker en tijdens de ontwikkeling”, concludeert Mandemaker.

Publicatie

The histone chaperone ANP32B regulates chromatin incorporation of the atypical human histone variant macroH2A. Imke K. Mandemaker, Evelyn Fessler, David Corujo, Christiane Kotthoff, Andreas Wegerer, Clément Rouillon, Marcus Buschbeck, Lucas T. Jae, Francesca Mattiroli en Andreas G. Ladurner. Cell Reports, 2023.

Francesca Mattiroli is groepsleider bij het Hubrecht Institute.