Genetisch ziekte repareren in menselijke stamcellen

Met het in 2018 in Amerika ontwikkelde nieuwe CRISPR-enzym is er een techniek die preciezer werkt en minder fouten maakt, leggen de onderzoekers Maarten Geurts van het Hubrecht Institute en Eyleen de Poel van het UMC Utrecht uit. Maarten: “Met de traditionele vorm van CRISPR-Cas wordt een bepaald stukje DNA weggeknipt, waarna de cel zichzelf moet herstellen, hopelijk door het te vervangen door een aangeboden, op het lab gemaakt, ‘goede’ stukje DNA. Met de nieuwe vorm van CRISPR-Cas wordt het precieze stukje DNA wel opgespoord, maar niet weggeknipt en vervangen; het wordt ter plekke gerepareerd.”

Eerder onderzoek liet zien dat deze nieuwe manier van genetisch corrigeren veilig is in stamcellen uit rijst en uit muizen. Het Utrechtse onderzoek heeft aangetoond dat de CRISPR-techniek ook effectief en veilig werkt op menselijke stamcellen. De resultaten van dit onderzoek onder leiding van de hoogleraren Hans Clevers (Hubrecht Institute) en Jeffrey Beekman (UMC Utrecht) zijn op 20 februari gepubliceerd in Cell Stem Cell.

Minidarmpjes
De stichting Hubrecht Organoid Technology en het UMC Utrecht beheren samen een biobank met zogenaamde darm-organoïden. Dit zijn een soort mini-darmpjes, gekweekt uit stamcellen van mensen met Cystic Fibrosis (CF), oftewel taaislijmziekte. De biobank opgezet is in samenwerking met CF-centra (in Nederland en de rest van Europa) en de Nederlandse CF-stichting. Op dit moment bevat de biobank organoïden van ongeveer 700 mensen met CF, ongeveer de helft van alle mensen met CF in Nederland. Deze organoïden worden gebruikt om te onderzoeken wat er precies misgaat bij taaislijmziekte. Daarnaast worden ze ingezet om te bepalen welk medicijn voor welke persoon met CF werkt, maar ook om nieuwe behandelingen, zoals CRISPR-Cas te testen. Voor dit onderzoek zijn ze gebruikt om te ontdekken of de nieuwe CRISPR-Cas methode werkt in menselijk DNA van stamcellen, oftewel of deze nieuwe techniek CF kan genezen in de minidarmpjes.

Wat gaat er mis bij CF?
CF wordt veroorzaakt door een foutje, ook wel een mutatie genoemd, in het CF-gen met als gevolg dat dit stukje gen niet meer werkt. Zoals alle genen is het CF-gen (CFTR) een stukje van een DNA-molecuul, die weer een klein onderdeel van een chromosoom is. Ieder chromosoom bestaat uit een lange reeks van vier soorten bouwstenen – nucleotiden – die A, T, G en C worden genoemd. De volgorde waarin deze nucleotiden aan elkaar zijn gekoppeld bevat de genetische informatie. Zij vormen een lange reeks van drie-letterige woorden die de cel de informatie geeft die hij nodig heeft om een gen goed te laten functioneren. Het gen dat bij CF is betrokken, bestaat uit ongeveer een kwart miljoen letters. Daarvan missen bij de meeste mensen met CF drie letters, dat is precies één DNA-woord.

Bij een kleinere groep is er sprake van een te vroeg stop-codon. Dat is gewoonlijk een drie- letterig DNA-woord aan het einde van de reeks, zodat de cel weet dat het gen daar eindigt. Door een foutje in het drie-letterige woord, bijvoorbeeld door een A op de plek waar normaal gesproken een G zou moeten zitten kan een stop-codon te vroeg voorkomen. Hierdoor denkt de cel denkt dat het gen daar eindigt. Dit zou te verhelpen zijn door de G in het stop-codon terug te veranderen in een A.

Deze beide groepen mensen met CF hebben dus een ander foutje in hun CF-gen maar met hetzelfde resultaat: Er wordt geen werkend CFTR-eiwit gevormd door de cel. In het lichaam is CFTR nodig voor het transport van chloride en water door de slijmvliescellen van organen als longen, alvleesklier, lever en darmen. Als dat niet gebeurt krijgt het slijm in de organen te weinig vocht en wordt het taai. Hierdoor werken diverse organen zoals de longen, alvleesklier en voortplantingsorganen niet goed en wordt de functie van deze organen steeds slechter.

Voor de grote groep mensen met CF, met het missende DNA-woord, is er inmiddels goedwerkende medicatie beschikbaar. Voor de tweede, kleine, groep met het foutje in het stop-codon niet. Daarom is de nieuwe CRISPR-techniek nu getest op stamcellen van mensen met CF met het te vroege stop-codon.

Wat kan de nieuwe CRISPR-techniek hierin betekenen?
Maarten legt uit wat de nieuwe CRISPR-Cas-techniek doet in het CF-gen. “Het Cas-deel van de traditionele CRISPR-Cas techniek, spoort het foute stukje DNA op en knipt het weg. Door dit Cas-deel aan te passen, spoort het nog steeds het betreffende stukje op, maar knipt het niet meer weg. Het doel is vervolgens het CF-gen te herstellen door het foute A te herstellen naar een G. Aan het CRISPR-Cas-enzym is daarom een eiwit gehangen dat het A op zo’n manier kapot maakt, dat het op een G lijkt. De cel – die kapotte nucleotiden zelf repareert – herkent hem nu als G en repareert hem als G. Zo wordt het stop-codon, niet meer als stop-codon gezien en kan het CF-gen weer volledig worden gemaakt.

Op deze manier is het gelukt om de CF-genen met een stop-codon in minidarmpjes uit de biobank te repareren. De cellen in de nieuwe minidarmpjes maakten het betreffende CFTR-eiwit wel aan. Maarten vertelt dat het mooie is dat dit CRISPR-enzym alleen dat blijkt te doen wat het moet doen. “Want dat is het grootste nadeel van de traditionele CRISPR-Cas techniek. Die blijkt niet alleen de ‘fout’ eruit te knippen, maar knipt ook deeltjes die erg op de fout lijken weg. Zo ontstaat onbedoelde DNA-schade. De nieuwe techniek is nauwkeuriger, herkent het foute DNA-deeltje beter en gaat alleen daar aan de slag. Dit is ook in ons onderzoek bevestigd, we hebben geen extra DNA-schade aangetroffen. Deze CRISPR-techniek lijkt dus niet alleen effectief, maar ook veilig te zijn.”

Hoe nu verder?
Dat nu is aangetoond dat deze techniek werkt in het laboratorium betekent niet dat patiënten er al van kunnen profiteren. Eyleen: “Een grote vraag is nog hoe je het CRISPR-enzym naar de juiste plekken in het lichaam brengt. CF is wat dat betreft ook niet de makkelijkste aandoening omdat het op zoveel verschillende lichaamsfuncties effect heeft. De reden dat wij voor ons onderzoek CF-cellen hebben gebruikt, is omdat we over die unieke biobank met mini-darmpjes beschikken. Bij aandoeningen die een enkel orgaan of celtype aantasten, zoals sikkelcelanemie, is de toepassing van CRISPR-Cas veelbelovend gebleken. Verder onderzoek is nodig om te kijken of ook deze nieuwe vorm van CRISPR in de kliniek toegepast kunnen worden. Maar mede door dit onderzoek kunnen we mogelijk de eerste klinische toepassing al binnen de komende vijf jaar verwachten.”

Daarnaast kleven aan het genetisch editen van cellen uiteraard ook ethische aspecten. Eyleen: “Wij focussen ons op het repareren van kapotte cellen. Theoretisch kan deze techniek ook ingezet worden voor het veranderen van cellen, bijvoorbeeld in embryo’s. Als dat mogelijk is, wil dat niet zeggen dat dat ook wenselijk is. Een maatschappelijke discussie is nodig om te bepalen hoe we als samenleving hiermee omgaan.”

Publicatie
CRISPR-based adenine editors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank. M.H. Geurts*, E. de Poel*, G.D. Amatngalim, R. Oka, F.M. Meijers, E. Kruisselbrink, P. van Mourik, G. Berkers, K.M. de Winter-de Groot, S. Michel, D. Muilwijk, B.L. Aalbers, J. Mullenders, S.F. Boj, S.W.F. Suen3, J.E. Brunsveld, H.M. Janssens, M.A. Mall, S.Y. Graeber, R. van Boxtel, C.K. van der Ent, J.M. Beekman†, H. Clevers†. Cell Stem Cell 2020.
*These authors contributed equally – †These authors are co-corresponding authors