CRISPR-HOT: nieuw gereedschap om specifieke genen en cellen te "kleuren"

Onderzoekers van de groep van Hans Clevers hebben een nieuw genetisch gereedschap ontwikkeld om specifieke genen in menselijke organoïden of mini-organen te labelen. Ze gebruikten deze nieuwe methode, genaamd CRISPR-HOT, om te onderzoeken hoe levercellen zich delen en hoe abnormale cellen met te veel DNA ontstaan. Door het kankergen TP53 uit te schakelen, lieten ze zien dat ongestructureerde delingen van abnormale levercellen vaker voorkwamen. Dit draagt mogelijk bij aan de ontwikkeling van kanker. De resultaten van dit onderzoek zijn gepubliceerd in het wetenschappelijke tijdschrift Nature Cell Biology.

Organoïden zijn mini-orgaantjes die in het lab kunnen worden gekweekt. Deze mini-organen groeien uit een heel klein stukje weefsel, en onderzoekers kunnen dit doen voor verschillende organen. Als onderzoekers deze organoïden ook genetisch kunnen veranderen zou dit veel bijdragen aan het bestuderen van biologische processen en het modelleren van ziekten. Tot nu toe is het maken van genetisch veranderde menselijke organoïden echter moeilijk gebleken, omdat een eenvoudige methode voor hiervoor tot nu toe ontbrak.

CRISPR-HOT
Een paar jaar geleden ontdekten onderzoekers dat CRISPR/Cas9, een kleine moleculaire schaar, erg nauwkeurig op een specifieke plek in het DNA kan knippen. Deze nieuwe technologie heeft de genbewerking enorm geholpen en vereenvoudigd. “De kleine wond in het DNA die ontstaat door et knippen, kan twee verschillende herstelmechanismen in de cellen activeren. Beide herstelmechanismen kunnen door onderzoekers gebruikt worden om de cellen te dwingen een nieuw stukje DNA toe te voegen op de plaats van de wond”, zegt Delilah Hendriks (Hubrecht Instituut). Men dacht dat een van deze methoden, de zogenaamde ‘non-homologous end-joining’, frequent fouten maakte. Daarom werd deze methode tot nu toe niet vaak gebruikt om nieuwe stukjes DNA in te voegen. “Omdat sommige eerdere onderzoeken bij muizen aangaven dat nieuwe stukjes DNA wél kunnen worden toegevoegd via non-homologous end-joining, zijn we dit gaan testen in menselijke organoïden”, zegt Benedetta Artegiani (Hubrecht Instituut). Artegiani en Hendriks ontdekten toen dat het inbrengen van een stukje DNA in menselijke organoïden via non-homologous end-joining eigenlijk een stuk efficiënter en robuuster is dan de andere methode die onderzoekers tot nu toe gebruiken. Ze noemden hun nieuwe methode CRISPR-HOT.

Ultrastructural definition of human liver cells. By coloring keratins, a protein that marks the skeleton of cells, the fine structural details of the skeleton (blue) in human liver ductal cells becomes visible. Credit: Benedetta Artegiani and Delilah Hendriks, ©Hubrecht Institute.

Cellen ‘kleuren’
De onderzoekers gebruikten vervolgens CRISPR-HOT om fluorescerende labels in het DNA van menselijke organoïden te plakken, zodat dat deze fluorescerende labels werden bevestigd aan specifieke genen die ze wilden bestuderen. Allereerst markeerden de onderzoekers erg zeldzame en specifieke cellen in de darm: de entero-endocriene cellen. Deze cellen produceren hormonen om bijvoorbeeld glucosespiegels, voedselinname en het leegmaken van de maag te reguleren. Omdat deze cellen zo zeldzaam zijn, zijn ze moeilijk te bestuderen. Met CRISPR-HOT konden de onderzoekers deze cellen echter gemakkelijk in verschillende kleuren ‘schilderen’, waarna ze deze cellen gemakkelijk konden identificeren en analyseren. Vervolgens ‘schilderden’ de onderzoekers organoïden die bestaan uit een specifiek celtype in de lever, de galkanaalcellen. Met behulp van CRISPR-HOT visualiseerden ze keratines, eiwitten die onderdeel zijn van het cel-skelet. De onderzoekers konden voor het eerst deze keratines met een hele hoge resolutie bekijken, en ontdekten een ontzettend fijne structuur. De keratines veranderen ook hun activiteit wanneer cellen zich specialiseren. Daarom verwachten de onderzoekers dat CRISPR-HOT nuttig kan zijn om het lot en de specificatie van cellen te bestuderen.

Abnormale celdeling in de lever
In de lever zijn er veel levercellen die twee (of zelfs meer) keer het DNA van een normale cel bevatten. Het is onduidelijk hoe deze cellen worden gevormd en of ze wel kunnen delen door deze abnormale hoeveelheid DNA. Oudere volwassenen bevatten meer van deze abnormale levercellen, maar het is onduidelijk of deze cellen betrokken zijn bij ziektes zoals kanker. Artegiani en Hendriks gebruikten CRISPR-HOT om specifieke componenten van de celdelings-machinerie in leverorganoïden te labelen en bestudeerden het proces van celdeling. Artegiani: “We zagen dat ‘normale’ levercellen zich zeer netjes delen en altijd in een bepaalde richting splitsen in twee dochtercellen”. Hendriks: “We zagen ook verschillende celdelingen waarin een abnormale levercel werd gevormd. Voor het eerst zagen we hoe een ‘normale’ levercel verandert in een abnormale levercel.” Daarnaast bestudeerden de onderzoekers de effecten van een DNA-verandering die vaak voorkomt in leverkanker, in het gen TP53, op abnormale celdeling in levercellen. Zonder TP53 waren deze abnormale levercellen veel vaker aan het delen. Dit zou een van de manieren kunnen zijn waarop TP53 bijdraagt aan de ontwikkeling van kanker.

De onderzoekers geloven dat CRISPR-HOT kan worden toegepast in veel soorten menselijke organoïden, om allerlei genen en celtypes te visualiseren en om veel verschillende ontwikkelings- en ziektegerelateerde vragen te bestuderen.

Publicatie
Fast and efficient generation of knock-in human organoids using homology-independent CRISPR–Cas9 precision genome editing. Artegiani B*, Hendriks D*, Beumer J, Kok R, Zheng X, Joore I, Chuva Sousa de Lopes S, van Zon J, Tans S, Clevers H. Nature Cell Biology 2020. Doi: 10.1038/s41556-020-0472-5.
*Deze auteurs hebben evenveel bijgedragen

Dit onderzoek is uitgevoerd in samenwerking met de groep van Sander Tans at AMOLF in Amsterdam. Hubrecht Organoid Technology leverde de darmorganoïden.

Hans Clevers is groepsleider bij het Hubrecht Institute en het Prinses Máxima Centrum voor kinderoncologie, hoogleraar Moleculaire Genetica bij het UMC Utrecht en de Universiteit Utrecht, en Oncode Investigator.