Toepassing van base editors in organoïden opent nieuwe deuren voor kankeronderzoek

Kanker is wereldwijd één van de belangrijkste doodsoorzaken. Voor het ontwikkelen van nieuwe behandelingen is het essentieel om de ziekte zo goed mogelijk te kunnen nabootsen in het laboratorium. Een manier om tumoren te modelleren is met organoïden: mini-organen die in het laboratorium gekweekt worden en een echt orgaan nabootsen. Tumor-organoïden kunnen gemaakt worden vanuit tumorweefsel van patiënten, maar het is ook mogelijk om gezond weefsel als basis te nemen. Om een specifieke tumorsoort hiermee te simuleren moeten in het DNA van de cellen mutaties worden aangebracht die kenmerkend zijn voor dat type kanker. Met behulp van de techniek CRISPR/Cas9 zijn onderzoeker Maarten Geurts en zijn collega’s hierin geslaagd en hebben ze modellen gemaakt voor leverkanker, darmkanker en baarmoederkanker. Deze tumor-organoïden kunnen gebruikt worden voor verder onderzoek, om zo het ontstaan van tumoren beter te leren begrijpen en nieuwe medicijnen te testen.

Puntmutaties aanbrengen

Om de benodigde mutaties in het DNA van de organoïden te krijgen, gebruikten de onderzoekers CRISPR/Cas9. Geurts legt uit hoe dat in zijn werk gaat: “In het lab gebruiken we CRISPR/Cas9 meestal om specifieke stukjes uit het DNA van een cel weg te knippen en zo een gen inactief te maken. Niet elke kanker ontstaat echter door zo’n inactiverende mutatie, soms worden genen juist actiever. Een aantal jaar geleden is de CRISPR/Cas9-techniek door wetenschappers verder ontwikkeld, waardoor we nu ook dit soort activerende mutaties kunnen aanbrengen in het DNA. We hebben nu namelijk bepaalde eiwitcomplexen tot onze beschikking, zogenaamde base editors, waarmee we heel gericht puntmutaties in het DNA kunnen aanbrengen. Dat houdt in dat we afzonderlijke ‘letters’ in de DNA-code kunnen aanpassen, bijvoorbeeld een A veranderen in een G. Wat wij nu hebben gedaan is deze techniek toepassen op normale, gezonde organoïden om zo specifieke combinaties van zowel activerende als inactiverende mutaties in te bouwen. Daarbij zijn we er ook in geslaagd om meerdere mutaties in één keer aan te brengen.”

Base editing in lever-organoïden

De onderzoekers pasten de techniek allereerst toe in lever-organoïden, waar ze verschillende activerende mutaties introduceerden op specifieke plekken in het gen CTNNB1. Dit gen is gemuteerd bij verschillende typen kanker, waaronder leverkanker. “Hiervoor hebben we drie verschillende base editors gebruikt en daarmee aangetoond dat deze allemaal gebruikt kunnen worden in menselijke organoïden,” zegt Geurts. Toen de onderzoekers vervolgens keken naar het effect van deze mutaties op de cellen, zagen ze het CTNNB1-eiwit terug op plekken in de cellen waar het niet thuishoort. “Normaal zit dit eiwit in het celmembraan, maar bij de organoïden met mutaties zagen we het in de celkern en het cytoplasma. Dit komt doordat het eiwit niet meer goed wordt afgebroken en er daardoor te veel van aanwezig is,” legt Geurts uit. “Opvallend was dat het precieze effect niet bij alle CTNNB1-mutaties hetzelfde was. Dit geeft ons aanknopingspunten om verder te onderzoeken hoe deze mutaties precies bijdragen aan de ontwikkeling van leverkanker.”

Hogere efficiëntie

Kanker wordt vaak veroorzaakt door een combinatie van mutaties in verschillende genen. Wanneer onderzoekers dit in organoïden zouden willen nabootsen met conventionele CRISPR/Cas9, zou elke afzonderlijke mutatie in een aparte reactie moeten worden toegevoegd: een proces dat tot drie maanden extra tijd kost per mutatie. Geurts en zijn team onderzochten daarom of het met base editors mogelijk was om op een efficiëntere manier meerdere mutaties in te bouwen in darm-organoïden. “We zijn erin geslaagd om in één reactie overactivering te creëren van één gen, PIK3CA, en tegelijkertijd twee andere genen, APC en TP53, uit te schakelen. Voorheen zouden we hier veel meer tijd mee kwijt zijn geweest. Dit is een heel waardevolle tijdsbesparing,” aldus Geurts.

Ontwikkeling van darmkanker in een petrischaaltje

De onderzoekers maakten vervolgens een biobank van darm-organoïden, waarmee ze verschillende stadia van darmkanker kunnen nabootsen. Elke combinatie van mutaties in vijf verschillende genen komt voor in deze mini-biobank van 128 organoïden. “Bij de ontwikkeling van een tumor, ook bij darmkanker, bouwt het aantal mutaties vaak op in de loop van de tijd. Daarom hebben we verschillende combinaties van veelvoorkomende mutaties ingebouwd in de organoïden om de ontwikkeling van een darmtumor na te bootsen. We hadden bijvoorbeeld organoïden met maar één mutatie, in het gen APC, maar ook exemplaren met daarbovenop één of meer extra mutaties. Daarbij zagen we duidelijk dat het uiterlijk van de organoïden verandert naarmate er meer mutaties aanwezig zijn: van mooi rond naar een steeds meer chaotische vorm. Dit komt overeen met het feit dat de organoïden een steeds verder gevorderd stadium van darmkanker representeren. Het maken van deze biobank was nu haalbaar omdat we de mutaties allemaal tegelijkertijd konden inbouwen met base editors en stelt ons in staat om de individuele stadia van darmkanker verder te gaan onderzoeken,” vertelt Geurts.

Deze video toont het verschil in uiterlijk tussen een gezond darm-organoïde zonder mutaties (eerste video) en een darm-organoïde met mutaties in APC, PIK3CA, SMAD4 en TP53 (tweede video). Credit: Maarten Geurts. Copyright: Hubrecht Institute.

Mogelijkheden voor toekomstig onderzoek

Geurts ziet vele toepassingen voor tumor-organoïden die zijn gemaakt met behulp van base editors. “Alles bij elkaar hebben we in deze studie tumor-organoïden gemaakt voor drie verschillende organen. Naast lever- en darmkanker zijn we er namelijk ook in geslaagd de eerste stappen in de ontwikkeling van baarmoederkanker na te bootsen en daar meer inzicht in te verkrijgen. We hebben dus aangetoond dat het met base editing mogelijk is om op een zeer efficiënte manier tumormodellen te maken van verschillende kankersoorten. Daarbij hebben we laten zien dat het mogelijk is om in één reactie tot wel vijf verschillende mutaties in te bouwen. Aangezien de efficiëntie van de reactie hierbij niet afnam, kunnen we dit in de toekomst misschien zelfs nog wel verder opvoeren. Inmiddels heeft onze groep deze techniek ook al toegepast op organoïden van andere organen. We zijn ervan overtuigd dat we hiermee een waardevolle tool hebben om verder onderzoek te doen naar het ontstaan, de ontwikkeling en de behandeling van allerlei soorten tumoren.”

Publicatie

One-step generation of tumor models by base editor multiplexing in adult stem cell-derived organoids. Maarten H. Geurts*^＋, Shashank Gandhi*, Matteo G. Boretto*, Ninouk Akkerman, Lucca L. M. Derks, Gijs van Son, Martina Celotti, Sarina Harshuk-Shabso, Flavia Peci, Harry Begthel, Delilah Hendriks, Paul Schürmann, Amanda Andersson-Rolf, Susana M. Chuva de Sousa Lopes, Johan H. van Es, Ruben van Boxtel en Hans Clevers^＋. Nature Communications, 2023.

* Deze auteurs hebben evenveel bijgedragen.
^＋ Gedeelde corresponderende auteurs van deze studie.